Blog

Jul 29, 2023

Effet antibactérien synergique des nanoparticules de cuivre et d'argent et leur mécanisme d'action

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9202 (2023) Citer cet article

Détails des métriques

Les infections bactériennes sont l'une des principales causes de décès dans le monde. Dans le cas d'infections bactériennes topiques telles que les infections de plaies, l'argent (Ag) a toujours été l'un des antibactériens les plus largement utilisés. Cependant, des publications scientifiques ont démontré les effets néfastes de l'argent sur les cellules humaines, une écotoxicité et un effet antibactérien insuffisant pour l'élimination complète des infections bactériennes. L'utilisation d'Ag sous forme de nanoparticules (NPs, 1–100 nm) permet de contrôler la libération d'ions Ag antibactériens mais n'est pas encore suffisante pour éliminer l'infection et éviter la cytotoxicité. Dans cette étude, nous avons testé la puissance des NP d'oxyde de cuivre (CuO) différemment fonctionnalisés pour améliorer les propriétés antibactériennes des NP Ag. L'effet antibactérien du mélange de NPs CuO (NPs CuO, CuO–NH2 et CuO–COOH) avec des NPs Ag (non enrobées et enrobées) a été étudié. Les combinaisons CuO et Ag NP étaient plus efficaces que Cu ou Ag (NPs) seuls contre un large éventail de bactéries, y compris les souches résistantes aux antibiotiques telles que les Escherichia coli à Gram négatif et les Pseudomonas aeruginosa ainsi que les Staphylococcus aureus à Gram positif, Enterococcus faecalis et Streptococcus dysgalactiae. Nous avons montré que les NP CuO chargées positivement amélioraient jusqu'à 6 fois l'effet antibactérien des NP Ag. Notamment, par rapport à la synergie des NP CuO et Ag, la synergie des ions métalliques respectifs était faible, ce qui suggère que la surface NP est nécessaire pour l'effet antibactérien amélioré. Nous avons également étudié les mécanismes de synergie et montré que la production d'ions Cu+, une dissolution plus rapide d'Ag+ à partir des Ag NPs et une liaison plus faible d'Ag+ par les protéines du milieu d'incubation en présence de Cu2+ étaient les principaux mécanismes de la synergie. En résumé, les combinaisons CuO et Ag NP ont permis d'augmenter l'effet antibactérien jusqu'à 6 fois. Ainsi, l'utilisation des combinaisons CuO et Ag NP permet de conserver d'excellents effets antibactériens dus à l'Ag et à la synergie et renforce les effets bénéfiques, puisque le Cu est un microélément vital pour les cellules humaines. Ainsi, nous suggérons d'utiliser des combinaisons de NP Ag et CuO dans des matériaux antibactériens, tels que des produits de soin des plaies, pour augmenter l'effet antibactérien de l'Ag, améliorer la sécurité et prévenir et guérir les infections bactériennes topiques.

Le développement de nouveaux antibactériens est l'une des principales priorités affichées par l'Organisation mondiale de la santé et la communauté scientifique1. Une méta-analyse récente a montré qu'il y avait eu 4,95 millions de décès associés à la résistance aux antibiotiques en 2019 et a souligné la nécessité d'une action urgente pour lutter contre les infections bactériennes résistantes aux antibiotiques2. L'infection des plaies est un type d'infection chronique qui peut entraîner des conséquences graves telles que l'amputation d'un membre et, si elle n'est pas prise en charge, la mort. Dans 15 à 27 % des cas, l'infection bactérienne des plaies entraîne une gangrène qui nécessite l'amputation du membre3, démontrant que les stratégies actuelles de gestion des infections des plaies sont inefficaces et que des approches améliorées sont nécessaires.

Dans le domaine des antibiotiques traditionnels, le concept synergique combinatoire est actuellement considéré comme l'une des approches les plus prometteuses pour traiter les infections bactériennes et éviter les résistances4. La combinaison de divers médicaments permet de réduire la dose des médicaments et donc, provoque moins d'effets secondaires par rapport à la monothérapie5.

Cependant, les antibiotiques sont administrés par voie systémique et leurs associations présentent des profils pharmacocinétiques imprévisibles. Les combinaisons de NP appliquées localement contourneraient ces inconvénients des antibiotiques systémiques. Ainsi, nous considérons l'application des NP synergiques comme très prometteuse. Nous émettons l'hypothèse qu'en raison des différents modes d'action sur les bactéries, les NP Cu et Ag ont une efficacité antibactérienne plus élevée lorsqu'ils sont appliqués ensemble, tandis que Cu améliore l'efficacité antibactérienne des NP Ag, les meilleurs antibactériens à base de métal connus à ce jour. De plus, le Cu est un microélément et est bénéfique pour la cicatrisation des plaies, stimulant la migration des fibroblastes, favorisant la synthèse du collagène, étant essentiel pour l'angiogenèse, favorisant la cicatrisation des plaies6 et la régénération osseuse7. Ainsi, les combinaisons Cu et Ag NP pourraient avoir un effet antibactérien supérieur, améliorer la cicatrisation des plaies et donc constituer un traitement très bénéfique pour les plaies infectées.

Séparément, les effets antibactériens des NP CuO et Ag sont bien étudiés. En utilisant les mots-clés « bactéries à nanoparticules d'argent* » ou « bactéries à nanoparticules de cuivre* * », la recherche dans PubMed® effectuée le 23 mars 2023 a permis d'obtenir respectivement 6 558 et 1 113 réponses.

Les mécanismes antibactériens des Ag NPs en soi sont relativement bien compris. Au contact des bactéries, les NP Ag se localisent sur la paroi cellulaire bactérienne et s'oxydent, entraînant la libération d'Ag concentré à l'interface NP-cellule8. Nous avons précédemment montré que les dommages à la paroi cellulaire des bactéries gram-négatives par les Ag NPs se produisent principalement au niveau de la membrane plasmique, alors que la membrane externe de la cellule bactérienne n'était pas une cible des NPs9.

Les mécanismes moléculaires des NP CuO sont moins étudiés. En 2008, Heinlaan et al. ont montré que la toxicité des NP CuO (EC50 = 79 mg/l) vis-à-vis des bactéries Vibrio fischeri mais aussi des crustacés était due aux ions Cu solubilisés10. Notamment, malgré ses excellents effets antibactériens, la toxicité de CuO pour les cellules humaines est inférieure à celle de l'Ag et des Ag NPs. Étant donné que Cu est un microélément vital, dans certains cas, les NP CuO facilitent des effets positifs tels que l'amélioration de l'angiogenèse et la cicatrisation des plaies6. Les mécanismes antibactériens détaillés des NP CuO ont été étudiés plus en détail à l'aide d'E. coli11 recombinant. Contrairement aux NP Ag qui n'ont pas provoqué d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans des conditions abiotiques, les NP CuO, en particulier celles chargées positivement, ont induit des niveaux significatifs de ROS. La charge de surface des NP peut être facilement modifiée par fonctionnalisation de surface et joue un rôle dans l'inactivation des bactéries. Étant donné que la paroi cellulaire des bactéries est chargée négativement, les NP chargées positivement peuvent mieux adhérer aux parois cellulaires bactériennes et inactiver les bactéries plus efficacement.

Nous étudions les NP antibactériennes depuis 2008 dans le but de comprendre les mécanismes de toxicité des NP et d'augmenter leur efficacité et leur innocuité1,8,9,10,12,13,14. Des articles récents et nos recherches ont démontré que l'effet antibactérien des NP peut être considérablement amélioré si des NP à base de métal ou des métaux respectifs sont utilisés en combinaison. Cependant, presque tous les travaux publiés précédemment se concentrent sur les effets combinés des ions métalliques et non sur les NP15,16,17,18. Parmi les diverses combinaisons de métaux étudiées (Ag avec Cu, Zn, Co, Cd et Ni), la combinaison d'Ag et de Cu a eu l'effet antibactérien synergique le plus élevé contre les bactéries Gram-négatives et Gram-positives19. Il y a un intérêt croissant pour la synergie entre Cu et Ag qui s'est manifesté dans de plus en plus d'articles publiés ces dernières années. La plupart d'entre eux ont décrit les propriétés antibactériennes des nanoalliages de Cu/Ag20,21 ou Cu/Ag avec l'ajout de certains autres métaux, par exemple le tungstène22. De plus, Jang et al. ont montré des propriétés anti-biofilm antibactériennes et cicatrisantes parfaites des composites Cu/Ag/oxyde de graphène dans le modèle de souris infectée23. Remarquablement, malgré ces articles décrivant la synergie antibactérienne entre Cu et Ag, nous n'avons identifié aucune publication étudiant systématiquement l'étude de l'effet synergique des combinaisons de NP ou de ses mécanismes.

Dans cette étude, nous avons émis l'hypothèse que le mécanisme antibactérien synergique des NP CuO et Ag est motivé par leurs mécanismes d'action complémentaires : les NP Ag endommagent les parois cellulaires bactériennes, facilitant l'entrée des NP CuO dans les bactéries, où les NP CuO perturbent les molécules intracellulaires. Plus précisément, nous avons d'abord décrit l'effet antibactérien synergique entre les NP Ag et CuO avec différents groupes fonctionnels contre diverses bactéries, y compris les bactéries multirésistantes. Dans un second temps, nous avons mené un ensemble de tests pour comprendre les mécanismes de la synergie antibactérienne des NPs : mesure des dommages de la membrane externe, induction de ROS, biodisponibilité des ions Cu et Ag et transformation de charge des ions Cu.

La caractérisation des NP utilisées dans cette étude est présentée dans le tableau 1. Les NP CuO (CuO) et CuO fonctionnalisé avec des groupes amino (CuO – NH2) avaient un potentiel zêta positif, CuO fonctionnalisé avec des groupes carboxyle (CuO – COOH) avait un potentiel zêta négatif. potentiel. Toutes les NP d'Ag testées avaient un fort potentiel zêta négatif allant de - 56, 6 mV dans le cas des nanoparticules d'argent enrobées (cAg) à - 27, 7 mV dans le cas du nanoargent (nAg). Dans le milieu de culture cellulaire RPMI (RPMI CCM), le potentiel zêta des NP était négatif pour toutes les NP allant de − 8,9 mV (CuO – NH2) à − 10,8 mV (CuO), probablement en raison de l'adsorption des protéines sériques (dite « corona protéique », un camouflage dynamique résultant de l'adhérence des protéines à la surface des NP) comme suggéré précédemment par Ivask et al.24. Ainsi, nous supposons que l'adsorption des protéines a masqué au moins en partie l'effet des charges NP dans toutes les expériences ultérieures. La dissolution parmi les Ag NPs était la plus élevée dans le cas de Ag2O et la plus faible dans le cas de nAg.

L'effet synergique a d'abord été caractérisé à l'aide du milieu de test de culture cellulaire RPMI car il contient du sérum sanguin avec des facteurs de croissance, ce qui le rend similaire au transsudat qui apparaît lors d'une infection tissulaire. Un exemple de l'effet antibactérien synergique des NP est illustré à la Fig. 1. Pour démontrer l'effet synergique, nous avons utilisé la concentration bactéricide minimale (MBC, la concentration testée la plus faible ne produisant aucune croissance bactérienne visible sur un milieu de croissance gélosé) comme proxy. Alors que 40 mg/l de NP Ag ou 400 mg/l de NP CuO étaient nécessaires pour inactiver de manière irréversible E. coli, seuls 5 mg/l de NP Ag + 25 mg/l de NP CuO étaient nécessaires lorsqu'ils étaient utilisés en combinaison (Fig. 1).

La synergie antibactérienne entre CuSO4 et cAg. La suspension d'Escherichia coli K-12 a été incubée avec différentes concentrations de NP Ag, de CuSO4 ou de leurs combinaisons dans un milieu de culture cellulaire RPMI pendant 24 h. Après incubation, 3 μl du mélange bactéries-NP ont été pipetés sur un bouillon gélosé et la concentration bactéricide minimale (MBC, la plus faible concentration testée ne produisant aucune croissance bactérienne visible après 24 h d'incubation à 37 ° C dans l'obscurité) a été déterminée. Les concentrations de cAg et CuSO4 sont indiquées sur les axes. La concentration bactéricide minimale de CuSO4 et de cAg était respectivement de 400 mg/L et 40 mg/L.

Pour quantifier et comparer l'effet synergique entre différentes NP et entre diverses souches bactériennes, nous avons introduit le terme "coefficient de synergie antibactérienne", K(AbS), montrant l'efficacité antibactérienne des combinaisons de NP (mélange) par rapport à la somme des valeurs de MBC de NP individuels et calculé comme suit (Eq. 1):

L'équation (1) montre le calcul du coefficient de synergie antibactérienne (K(AbS) à partir de concentrations bactéricides minimales (MBC).

Un calcul de synergie similaire a été rapporté précédemment pour des mélanges de métaux par Vaidya et al.16. K(AbS) > 1 marque la synergie, K(AbS) = 1 marque l'effet additif ou K(AbS) < 1 marque l'antagonisme.

La figure 1 montre que le MBC du mélange de NP cAg et CuO est plusieurs fois inférieur au MBC des composants séparément. Selon la formule de \({\text{K}}\left( {{\text{AbS}}} \right) = 1/\left( {\frac{{50\;{\text{mg}}/ {\text{L}}}}{{400\;{\text{mg}}/{\text{L}}}} + \frac{{2.5\;{\text{mg}}/{\text {L}}}}{{40\ ;{\text{mg}}/{\text{L}}}}} \right)\) = 1/(1/8 + 1/16) = 5,33. Ainsi, dans cet exemple, l'effet antibactérien du mélange était 5,33 fois supérieur à la somme des effets antibactériens des composants séparément.

Les calculs pour le mélange de 25 mg/L de CuSO4 + 5 mg/L de cAg donnent le même K(AbS). Cependant, K(AbS) est plus faible dans d'autres variations des rapports CuSO4/cAg (par exemple 200 mg/L de CuSO4 + 1,5 mg/L de mélange cAg). La différence entre K(AbS) en fonction du rapport Cu/Ag est illustrée dans la Fig. 1 supplémentaire. Le K(AbS) le plus élevé a été principalement observé en utilisant le rapport de 1:1 à 12,5:1 Cu/Ag.

Les valeurs MBC de différents composants Cu seuls et dans le mélange avec cAg dans différentes bactéries sont présentées dans le tableau supplémentaire 1. similaire à celle des autres bactéries.

Le K (AbS) calculé pour différentes bactéries est illustré à la Fig. 2. L'effet synergique antibactérien évident entre la plupart des composés de Cu et les NP d'Ag a été trouvé (Fig. 2, Tableau supplémentaire 1).

Coefficient de synergie antibactérienne entre les composants cAg et cuivre de différentes bactéries dans le milieu de culture cellulaire RPMI. Les valeurs moyennes avec écart type sont indiquées. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001. cAg, nanoparticules d'argent enrobées ; CuO Oxyde de cuivre ; CuO–NH2, oxyde de cuivre recouvert de groupes amino ; CuO – COOH, oxyde de cuivre recouvert de groupes carboxy ; CuSO4, sulfate de cuivre.

Parmi les NP CuO, le K(AbS) le plus élevé avec cAg a été observé avec CuO non fonctionnalisé et surtout CuO–NH2, tous deux chargés positivement. Le K (AbS) le plus bas a été observé avec CuO – COOH chargé négativement, étant généralement inférieur à 2. Cela suggère que la charge vierge des NP CuO (reflétée dans le potentiel zêta dans l'eau MQ) a affecté la synergie antibactérienne. Fait intéressant, la charge des NP était uniforme dans le milieu de culture cellulaire en raison de la couronne protéique (tableau 1). Cela suggère que certaines surfaces vierges de NP sont restées disponibles même après la formation de la couronne protéique dans le milieu de culture cellulaire.

Le K(AbS) le plus élevé a été observé pour E. faecalis et E. coli (K-12 et BLSE). Il est intéressant de noter que E. coli BLSE est plus résistante aux antibiotiques par rapport à E. coli K12 et était également plus résistante au cAg dans cette étude. Cependant, les valeurs de K(AbS) étaient similaires dans le cas de ces bactéries. Pour E. faecalis, un K(AbS) élevé a été observé pour toutes les combinaisons qui peuvent être le résultat d'un taux plus rapide de destruction de l'ADN par les composants Cu par rapport aux entérobactéries (telles que E. coli)25.

P. aeruginosa avait le K(AbS) le plus bas de toutes les bactéries testées. La raison en est peut-être le puissant système d'efflux antidrogue et la diminution de la perméabilité de la membrane externe26.

Nous avons mené des études supplémentaires avec divers NP Ag et AgNO3 pour déterminer lesquels d'entre eux auraient une synergie antibactérienne plus forte avec les composants Cu.

Le tableau supplémentaire 2 montre les découvertes de MBC dans E. coli K-12 avec divers composants Ag et Cu dans le mélange et seuls. Les K(AbS) calculés sont présentés à la Fig. 3.

Coefficient de synergie antibactérienne (K(AbS)) entre les différents composants Ag et Cu dans les milieux de culture cellulaire RPMI avec la souche Escherichia coli K-12. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001, ##P < 0,01 antagonisme. Remarque K(AbS) a été calculé en tant que K(AbS) moyen à partir de différentes expériences, et non à partir du MBC moyen des composants du mélange ou seuls. Les valeurs moyennes avec écart type sont indiquées. cAg, nanoparticules d'argent enrobées ; nAg, nanoargent ; Ag2O, oxyde d'argent ; AgNO3, nitrate d'argent ; CuO, oxyde de cuivre ; CuO–NH2, oxyde de cuivre recouvert de groupes amino ; CuO – COOH, oxyde de cuivre recouvert de groupes carboxy ; CuSO4, sulfate de cuivre.

Lorsqu'ils sont mélangés avec des composants Cu, la plupart des NP Ag ont montré un K (AbS) élevé. En revanche, AgNO3 n'a pas démontré de forte synergie antibactérienne avec les composants Cu (Fig. 3, Tableau supplémentaire 2). Les K(AbS) les plus élevés ont été observés pour trois mélanges : cAg avec CuSO4 et nAg avec CuSO4/CuO–NH2. Le fait que CuSO4 et CuO–NH2 étaient bien dissous (tableau 1) et donc, étaient une source d'ions Cu, suggère que les ions Cu sont nécessaires pour la synergie. Le résultat atypique de K(AbS) était dans le mélange d'Ag2O et de CuSO4 (pas de synergie). Contrairement à cAg et nAg, les NP Ag2O étaient plus oxydées (dissoutes). Ces données indiquent fortement que les NPs Ag non oxydées et les ions Cu sont tous deux nécessaires pour obtenir le fort effet synergique antibactérien.

Ensuite, nous avons étudié si le milieu de culture avait un effet sur la synergie antibactérienne. Le MBC de cAg, CuSO4 et leurs mélanges dans différents milieux est présenté dans le tableau supplémentaire 3 et K (AbS) dans la Fig. 4. Dans un milieu de croissance bactérienne à haute teneur en protéines et nutriments, K (AbS) était plus élevé. Le K (AbS) le plus élevé était dans le milieu LB et le plus bas dans le MQ (Fig. 4). Il est important de noter que la croissance des bactéries était également la plus rapide dans LB (Fig. 2 supplémentaire). Cela suggère que la synergie est plus importante pour les cellules en phase active et en division. Très probablement, dans des conditions de croissance bactérienne active, les NP et les ions métalliques libérés par les NP ont un meilleur accès à l'espace intracellulaire pour détruire l'ADN27 et endommager les protéines. Fait intéressant, les antibiotiques traditionnels inactivent également les bactéries moins efficacement dans la phase de non-croissance, en particulier S. aureus28.

Coefficient de synergie antibactérienne dans différents milieux. Coefficient de synergie antibactérienne dans le mélange de nanoparticules d'argent enrobées et de sulfate de cuivre dans différents milieux de croissance contre la souche Escherichia coli K-12. Les valeurs moyennes avec les écarts types sont indiquées. Eau MQ MilliQ, RPMI.

Plusieurs tests complémentaires ont été réalisés pour comprendre les mécanismes de synergie antibactérienne entre Cu et Ag. Il a été émis l'hypothèse que la synergie antibactérienne est fonction des différents modes d'action du Cu et de l'Ag. L'interaction des antibiotiques bêta-lactamines, qui endommagent la membrane cellulaire de la bactérie, et des aminoglycosides, qui inhibent la synthèse des protéines chez les bactéries, est un exemple bien connu de la synergie classique des antibiotiques. La synergie entre les aminoglycosides et les β-lactamines a été attribuée aux lésions membranaires médiées par les β-lactamines entraînant une absorption accrue des aminoglycosides29.

Une hypothèse était que l'un des composants (Cu ou Ag NPs) endommage davantage la membrane, permettant à un autre composant de pénétrer plus facilement dans la cellule et d'endommager les structures internes. La polymyxine B, qui perturbe les membranes bactériennes externes des cellules Gram-négatives30, a été utilisée comme témoin positif dans cette expérience. Pour vérifier l'hypothèse, la perméabilité de la membrane externe de deux bactéries Gram-négatives, E. coli K-12 et Pseudomonas aeruginosa PAO1, a été mesurée. Les résultats ont montré que AgNO3 et cAg endommageaient la membrane externe des deux bactéries (Figs. 5a, b). cAg a nécessité plus de temps pour endommager la membrane par rapport à AgNO3, et la membrane de P.aeruginosa a nécessité plus de temps pour être endommagée par rapport à E. coli. Les NP CuO et CuSO4 n'ont pas causé de dommages remarquables à la membrane, en particulier chez P. aeruginosa. Ces données suggèrent que l'un des moyens d'inactiver les cellules dans le cas des composés Ag est de détruire les membranes externes des bactéries, alors que les composés Cu agissent sur d'autres structures cellulaires (même des concentrations élevées de Cu qui conduisent à la mort cellulaire en 24 h ne n'entraînent pas une destruction rapide de la membrane externe). La destruction de la membrane par Ag pourrait aider Cu à atteindre ces structures cellulaires internes dans le cas d'un mélange Ag et Cu. Sur la base de ces données, nous avons décidé de tester cette hypothèse en mélangeant des composés Cu et Ag. Un test avec un mélange de composés de Cu et de cAg a également été réalisé. L'action dommageable de cAg sur la membrane n'a pas été affectée par l'ajout de CuSO4 ou de Cu – NH2 (Fig. 5c, d). Des tests avec l'ajout de CuO – COOH ou CuO à cAg ont également été effectués, et l'effet destructeur supplémentaire sur la membrane n'a pas été détecté (non illustré) ainsi qu'avec l'ajout de CuSO4 ou Cu – NH2. De plus, l'ajout de composants Cu à la polymyxine B, qui endommage rapidement la membrane externe, n'a pas amélioré l'effet de la polymyxine B sur la membrane (données non présentées). De plus, l'effet synergique antibactérien entre CuSO4 et la polymyxine B dans E. coli K-12 dans le test MBC n'a pas été détecté (K(AbS) = 1,054 ± 0,243, données non présentées). Ainsi, nous avons conclu que l'Ag et le Cu agissent différemment sur la membrane externe bactérienne mais que leur action sur la membrane externe n'est pas la cause principale de la synergie antibactérienne.

Endommagement de la membrane bactérienne externe par des composés d'Ag et de Cu ou leur combinaison. L'augmentation de la fluorescence indique les dommages de la membrane externe d'Escherichia coli (a, c) et de Pseudomonas aeruginosa (b, d) après 30 min d'incubation avec les composants seuls (a, b) et dans les mélanges avec cAg (c, d) . Les valeurs moyennes avec écart type sont indiquées. cAg, nanoparticules d'argent enrobées ; AgNO3, nitrate d'argent ; CuO, oxyde de cuivre ; CuO–NH2, oxyde de cuivre recouvert de groupes amino ; CuO – COOH, oxyde de cuivre recouvert de groupes carboxy ; CuSO4, sulfate de cuivre ; PB, Polymyxine B.

La possibilité pour les ions Cu de faire un cycle redox entre Cu+/Cu++ est connue sous le nom de réaction de type Fenton, et elle peut générer des espèces réactives de l'oxygène (ROS) entraînant une peroxydation des lipides, une oxydation des protéines et des dommages à l'ADN31. Nous avons ensuite émis l'hypothèse que la production accrue de ROS pourrait être la raison de la synergie entre les composants Cu et Ag. En effet, il a déjà été démontré que CuO NPs13 et Ag NPs32 induisaient des ROS. Nous avons également démontré précédemment que CuO – NH2 induisait plus de ROS que CuO et CuO – COOH13 non fonctionnalisés.

La génération de ROS dans cette étude a été déterminée à la fois dans des conditions biotiques (en présence de bactéries) et abiotiques (sans bactéries) (Fig. 6). Les niveaux les plus élevés de ROS ont été détectés dans des suspensions individuelles de cAg et CuO – NH2 (Fig. 6a, b). cAg a induit les niveaux de ROS les plus élevés dans des conditions abiotiques (Fig. 6a), tandis que CuO – NH2 dans des conditions biotiques (Fig. 6b). Aucun ROS n'a été détecté dans le cas de CuSO4 et AgNO3.

Production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les suspensions. Mesure de l'induction de ROS dans des conditions abiotiques (a, c) et biotiques (b, d). La mesure de l'induction de ROS a été effectuée après incubation avec des composants seuls (a, b) ou dans le mélange de composants cAg et Cu dans un rapport 1: 4 (c, d). cAg, nanoparticules d'argent enrobées ; AgNO3, nitrate d'argent ; CuO, oxyde de cuivre ; CuO–NH2, oxyde de cuivre recouvert de groupes amino ; CuSO4, sulfate de cuivre ; RFU, unités de fluorescence relative.

Les ROS dans le mélange de composants cAg et Cu (dans un rapport de 1: 4) ont été testés pour contrôler l'hypothèse selon laquelle le cAg produira plus de ROS après l'ajout de CuSO4 ou CuO – NH2. Les résultats ont montré que l'ajout de CuO – NH2 ou CuSO4 à cAg n'améliorait pas la production de ROS dans des conditions biotiques et abiotiques (Fig. 6c, d). De plus, un antagonisme a été détecté (par exemple, des ROS plus faibles dans le mélange de composants cAg + Cu par rapport au cAg seul), indiquant que les ROS n'étaient pas la cause de la synergie antibactérienne.

Étant donné que la toxicité des NP à base de métaux est principalement causée par leurs ions10,33, nous avons décidé de mesurer les ions Cu et Ag intracellulaires. Pour cela, nous avons utilisé le biocapteur bioluminescent E. coli MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux, qui produit de la luciférase en réponse au Cu intracellulaire et à l'Ag34. Dans cette bactérie, les ions intracellulaires Ag et Cu induisent la luminescence des bactéries de manière dose-dépendante.

Étant donné que les bactéries biocapteurs ne sont pas sélectives et détectent à la fois les ions Ag et Cu, il n'a pas été possible de déterminer Ag et Cu intracellulaires individuellement. Par conséquent, nous avons utilisé les valeurs relatives et le coefficient de synergie inductive K(InS). K(InS) a été calculé de la même manière que le coefficient de synergie antibactérienne. K(InS) est l'inverse de la somme des rapports des concentrations maximales de bioluminescence (LC) des composants dans le mélange aux concentrations maximales LC seules (Eq. 2).

L'équation (2) montre le calcul du coefficient de synergie inductive (K(InS)) à partir des concentrations maximales de bioluminescence (LC) (conc).

Au début, la bioluminescence des bactéries avec des composants Ag et Cu individuels a été mesurée (Fig. 7a). Ensuite, nous avons mélangé les composants Cu avec cAg, et nous avons trouvé un décalage significatif du pic de LC vers la gauche (Fig. 7b), mais aucun décalage lors du mélange avec AgNO3 (Fig. 7c). Les concentrations maximales de LC des composants séparément et dans le mélange sont indiquées dans le tableau supplémentaire 4.

Luminescence des bactéries biocapteurs en réaction aux composants. Luminescence (LC) d'Escherichia coli MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux en réaction à une incubation de 4 h avec les composants seuls (a). Le décalage significatif du pic LC vers la gauche dans le mélange de composants de cuivre avec cAg par rapport à cAg seul (b). Aucun décalage du pic LC dans le mélange de composants de cuivre avec AgNO3 par rapport à AgNO3 seul (c). Les chiffres représentatifs proviennent de 3 expériences indépendantes. cAg, nanoparticules d'argent enrobées ; AgNO3, nitrate d'argent ; CuO, oxyde de cuivre ; CuO–NH2, oxyde de cuivre recouvert de groupes amino ; CuO – COOH, oxyde de cuivre recouvert de groupes carboxy ; CuSO4, sulfate de cuivre.

La forte induction de bioluminescence en réponse à la concentration intracellulaire d'ions Cu et Ag a été observée dans les mélanges de composants Cu avec cAg (Fig. 7b). Des concentrations plus faibles de composants cAg et Cu dans les mélanges étaient nécessaires pour l'induction de la réponse. En combinaison de composants Cu avec cAg, tous les mélanges testés ont montré un K(InS) élevé, mais pas dans les mélanges de composants Cu et AgNO3 (Fig. 8). Le fait que K (InS) était remarquablement supérieur à 1 dans le cas des mélanges de composants cAg et Cu a révélé que les bactéries biocapteurs détectaient des concentrations intracellulaires plus élevées d'ions métalliques dans le mélange de composants cAg et Cu par rapport à la somme des composants séparément. Cela n'a pas été attribué aux dommages à la membrane causés par le cAg et à un meilleur accès du Cu aux composants internes des cellules (Fig. 5c, d). On peut supposer que la concentration intracellulaire d'Ag, lorsqu'il est combiné avec CuSO4, était plus élevée en raison d'une meilleure dissolution de cAg en présence de Cu2+. De plus, la dissolution de AgNO3 est très élevée et ne peut pas être améliorée par les ions Cu, c'est pourquoi nous n'avons pas observé l'effet synergique entre les composants Cu et AgNO3.

Coefficient de synergie inductive dans un mélange de composants Cu et Ag. L'induction de la bioluminescence chez les bactéries était plus élevée en réponse au mélange de composants cAg et Cu par rapport aux composants seuls. Cette réaction améliorée n'a pas été détectée dans le mélange de NP AgNO3 et CuO. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001, ##Antagonisme P < 0,01. cAg, nanoparticules d'argent enrobées ; AgNO3, nitrate d'argent ; CuO, oxyde de cuivre ; CuO–NH2, oxyde de cuivre recouvert de groupes amino ; CuO – COOH, oxyde de cuivre recouvert de groupes carboxy ; CuSO4, sulfate de cuivre.

Ensuite, nous avons étudié la dissolution des Ag NPs dans l'eau et le RPMI CCM dans deux conditions différentes : avec et sans ajout de CuSO4. Nous avons trouvé une différence significative entre la dissolution des NP Ag avec et sans ajout de CuSO4 (Fig. 9). Dans l'eau MQ, la différence de dissolution de nAg et Ag2O était plus de 4 fois et 2 fois respectivement après l'ajout de CuSO4. Alors que dans le RPMI CCM, la différence de dissolution de nAg était plus de 16 fois après l'ajout de CuSO4 (Fig. 9). Nous supposons que dans le mélange de nAg et de CuSO4 dans l'eau, il y a un effet d'amélioration de la dissolution des NP d'Ag par l'équation suivante. 3 :

Dissolution de nanoparticules d'argent. Pourcentage de dissolution des composants d'argent (100 mg/L) dans l'eau et dans le RPMI CCM avec et sans ajout de CuSO4 (400 mg/L) après 24 h d'incubation dans un agitateur à 37 °C. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001. cAg, nanoparticules d'argent enrobées ; nAg, nanoargent ; Ag2O, oxyde d'argent ; AgNO3, nitrate d'argent ; CuSO4, sulfate de cuivre ; RPMI CCM, milieu de culture cellulaire du Roswell Park Memorial Institute.

L'équation (3) montre la réaction redox entre les composants de cuivre et d'argent.

Dans le RPMI, la réaction est très probablement influencée par des composés organiques. Par exemple, la dissolution d'AgNO3 dans du RPMI CCM contenant du sérum peut être de 100 %, mais la plupart des ions Ag+ libres sont complexés par des protéines sériques35. Étant donné que les ions Cu empêchent les ions Ag de se lier aux protéines sériques, il y avait une différence significative dans la concentration d'ions Ag libres dans une solution d'AgNO3 dans du RPMI CCM avec et sans CuSO4. Ces deux effets sont présents dans une suspension de nAg et de CuSO4 dans du RPMI CCM, ce qui entraîne une augmentation de 16 fois de la quantité d'ions Ag libres dans un échantillon contenant du CuSO4 par rapport à un échantillon sans CuSO4 (Fig. 9). De plus, comme décrit précédemment, Ag2O déjà oxydé n'avait pas de synergie antibactérienne dans le RPMI CCM avec CuSO4 et nous n'avons pas observé de meilleure dissolution d'Ag2O dans ce solvant après l'ajout de CuSO4 (Fig. 9).

Comme mentionné dans la section précédente (Eq. 3), Cu+ est produit dans le mélange de Ag NPs et d'ions Cu2+. Pour prouver la présence de Cu+ dans le mélange, une réaction chimique qualitative a été effectuée comme décrit dans la section Méthodes. Dans un mélange de composants, la réaction qualitative a prouvé la présence de Cu+, mais pas dans les solutions de suspension de nAg, AgNO3 ou CuSO4 séparément. Cette enquête a démontré que l'équilibre a été établi comme prévu. De plus, il a été montré précédemment que Cu+ a un effet antibactérien supérieur à Cu2+36,37, en raison de la capacité de Cu+ à générer des radicaux OH en présence de superoxyde dans une réaction analogue à la réaction de type Fenton38. Par conséquent, la formation d'ions Cu+ supplémentaires dans la solution peut être parmi les principaux facteurs affectant la synergie antibactérienne du système Ag NP/Cu2+.

Généralement, la synergie se produit lorsque les composants ont des mécanismes d'action différents. Bien que la synergie antibactérienne entre les composants Ag et Cu (principalement des métaux et non des NP) ait été décrite auparavant, les mécanismes de synergie n'ont pas été étudiés. Des publications antérieures ont suggéré certains mécanismes de synergie antibactérienne, alors que les auteurs ont principalement émis l'hypothèse que Ag cible la membrane plasmique bactérienne, tandis que Cu dénature les acides nucléiques et d'autres biomolécules internes et structures cellulaires15,16,19,22. En revanche, dans notre étude, nous n'avons pas observé de synergie remarquable entre les composants Cu et AgNO3 (Fig. 2) ou la polymyxine B, qui ont tous deux causé des dommages remarquables à la membrane (Fig. 5).

En outre, il a été proposé que les ions Cu libérés par les alliages CuO inactivent les bactéries en stimulant la production de ROS provoquant des dommages à l'ADN et une peroxydation des lipides16,19,22. De plus, les NP Ag ancrées sur CuO et Cu(OH)2 produisaient des ROS en plus grande quantité par rapport à CuO39, mais dans ce cas, la production de ROS pourrait être améliorée grâce à Cu(OH)2. Cependant, nous n'avons pas observé de production significative de ROS dans une solution de CuSO4 dans des conditions biotiques ou abiotiques, alors que la production de ROS par cAg était remarquablement plus élevée. Au contraire, l'ajout de CuSO4 a réduit la quantité de production de ROS dans la suspension de cAg dans des conditions biotiques et abiotiques (Fig. 6).

Jang et al. (2020) ont montré que la libération d'ions Ag+ de NP était significativement plus élevée dans la solution avec la concentration la plus élevée d'ions Cu2+23. De plus, la libération plus élevée d'Ag+ était liée à la température plus élevée et à la durée d'incubation plus longue des NP21. Ce mécanisme de synergie est en accord avec les résultats de notre étude.

Nos recherches ont montré qu'une combinaison de NPs Ag non oxydées et d'ions Cu est essentielle pour l'effet antibactérien synergique. La synergie antibactérienne entre les NP Ag et les composants Cu, selon notre étude, a au moins trois raisons. Premièrement, les ions Cu facilitent l'oxydation de l'Ag0 non oxydé (Eq. 3) dans une réaction redox et, par conséquent, une meilleure dissolution de l'Ag+ à partir des NP Ag dans les solvants en présence de Cu2+ (Fig. 9). En effet, Ag0 non oxydé dans les NPs est nécessaire pour la réaction redox avec Cu2+ pour produire Ag+ et Cu+. Une meilleure dissolution des Ag NPs conduit à une concentration plus élevée d'Ag+ dans le solvant et intracellulairement chez les bactéries (Fig. 7), provoquant un effet antibactérien plus fort. La deuxième raison est la production d'ions Cu+ dans la même réaction redox (Eq. 3). Les ions Cu+ sont plus antibactériens que Cu2+38. La troisième raison est que les ions Ag libres se lient moins efficacement aux protéines dans le milieu de culture en présence de Cu2+, ce qui entraîne une plus grande concentration d'Ag+ libre dans la solution (Fig. 9). Ainsi, la libération des ions Cu2+ des NP CuO est nécessaire pour l'action synergique. Tous les processus décrits peuvent se produire à la fois de manière extracellulaire et intracellulaire, alors que ce dernier est plus nocif pour l'homéostasie cellulaire. De plus, d'autres facteurs, tels que le potentiel zêta et la fonctionnalisation de la surface NP, pourraient avoir des effets mineurs sur la synergie antibactérienne, mais pour le prouver, des études supplémentaires sont nécessaires.

Ag et Cu ont été utilisés séparément comme agents antibactériens depuis l'Antiquité. Notre étude a montré que l'effet antibactérien du mélange de NP contenant des composants Ag et Cu était jusqu'à six fois supérieur à la somme des effets antibactériens des composants individuels. Les mécanismes de la synergie sont : une meilleure dissolution de l'Ag en présence d'ions Cu du fait de l'oxydation dans la réaction redox, la production d'ions Cu+ plus antibactériens lors de la même réaction redox et une liaison moins favorable des ions Ag aux protéines moyennes en présence d'ions Cu. La synergie antibactérienne entre Ag et Cu pourrait être une solution idéale pour certains problèmes médicaux où l'élimination de l'infection est nécessaire et où l'effet antibactérien de l'Ag ou du Cu seul n'est pas suffisant. Par exemple, les résultats de l'étude peuvent être utilisés pour développer des nanotechnologies combinatoires à utiliser dans les pansements antibactériens pour traiter les plaies infectées. Étant donné que le traitement de certaines infections bactériennes des plaies est un problème non résolu, le traitement combiné des plaies à base de NP Cu et Ag pourrait réduire les complications de l'infection des plaies (telles que les gangrènes et les amputations liées à l'infection) et augmenter les années de vie ajustées sur la qualité (QALY) des les patients.

Tous les produits chimiques étaient au moins de qualité analytique. La polymyxine B et le NaCl ont été achetés chez Sigma-Aldrich Co. (USA); AgNO3 de JT Baker (USA), CuSO4 d'Alfa Aesar Gmbh & Co. (Allemagne) ; le diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine de Life Technologies (USA) ; solution saline tamponnée au phosphate de Biognost (Croatie); tryptone, extrait de levure et gélose de LabM (Royaume-Uni) ; RPMI 1640 avec glutamine et pyruvate de sodium de Corning (USA); Sérum Fœtal Bovin de Gibco (USA).

Trois types de NP CuO fonctionnalisés et non fonctionnalisés ont été obtenus auprès de PlasmaChem GmbH (Allemagne). Les NP CuO ont été synthétisés par PlasmaChem par décomposition de Cu2CO3(OH)2, suivie de l'introduction des groupes de surface via un traitement avec de l'acide mercaptopropionique. Les NP d'Ag enrobées (cAg) ont été obtenues auprès de Laboratorios Argenol SL (Espagne), les NP d'Ag non enrobées (nAg) de Sigma-Aldrich (USA). Nous avons synthétisé les NP Ag2O (Ag2O) comme décrit ci-dessous.

Les NP commerciales ont été fournies sous forme de poudres sèches, et les suspensions ont été fraîchement préparées à chaque fois avant les tests à des concentrations de 2000 mg de composé/l dans de l'eau Milli-Q® sans endotoxine (MQ). Dix millilitres de suspensions de CuO NPs ont été vortexés et soniqués à l'aide d'une sonication par sonde (Branson 450 Sonifier, USA) pendant 5 min avec une puissance acoustique de 13 W correspondant à l'énergie spécifique de 3,9·105 kJ/m340.

La morphologie et la taille primaire de toutes les NP sauf Ag2O ont été caractérisées dans nos études précédentes8,13,41.

La caractérisation des NP Ag2O par cristallographie aux rayons X et microscopie électronique à transmission a été réalisée à l'Université de Tartu. Les mesures de microscopie électronique à transmission à balayage (STEM) ont été effectuées avec l'instrument FEI Titan Themis 200 corrigé Cs. Les échantillons ont été préparés dans de l'alcool isopropylique, soniqués et déposés sur des grilles TEM recouvertes d'un film de carbone. Après évaporation du solvant, les échantillons ont été mesurés simultanément avec des détecteurs à champ clair (BF) et à champ noir annulaire à angle élevé (HAADF).

La taille hydrodynamique (Dh), l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta (potentiel zêta) des NP ont été mesurés dans des suspensions de 100 mg/l dans de l'eau MQ ou dans un milieu de culture cellulaire du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec 10 % de FBS et 1 % de pyruvate de sodium (RPMI CCM) à l'aide de Malvern Zetasizer (Zetasizer Nano-ZS, Malvern Instruments, Royaume-Uni).

La teneur en métal des composés testés a été déterminée par spectroscopie d'absorption atomique (AAS) (contrAA 800, Analytik Jena Ag). Les matériaux et les nanoparticules ont été incubés dans 1 ml de HNO3 concentré (Nitric Acid TraceMetal Grade 67–69%, Seastar Chemicals) pendant 24 h à 65÷C. Après incubation, la suspension a été vortexée et diluée à 1:1000 dans 1% HNO3. Le tissu et le sérum sanguin ont été incubés dans du H2O2 (Perdrogen 30 %, Sigma-Aldrich) et du HNO3 concentré selon le rapport suivant 1:1:8 (tissu : H2O2 : HNO3) et incubés pendant 24 h à 65 ÷ C. Après incubation, le suspension a été diluée 10 fois dans du HNO3 à 1 % et analysée par AAS. Les mesures ont été faites en triple dans au moins deux expériences indépendantes.

Le nitrate d'argent de qualité réactif analytique (anhydre, avec une pureté supérieure à 99,9%) (5 mmol, 0,85 g) a été dissous dans 50 ml d'eau DI et soumis aux ultrasons pendant 1 min pour obtenir une solution homogène à température ambiante.

Après la dissolution totale du nitrate d'argent, de l'hydroxyde de sodium (10 mmol, 0,39 g) a été rapidement ajouté au mélange réactionnel dans des conditions ambiantes et soumis aux ultrasons pendant 2 h.

La solution finale a été refroidie. Ensuite, le précipité noirâtre obtenu a été filtré sur du papier filtre Whatman (grade 5) et désactivé deux fois avec 50 ml d'eau MQ. Le résidu noir a ensuite été séché à 70 °C pendant 12 h, donnant des rendements supérieurs à 60 %.

Escherichia coli MG1655 K-12 (E. coli K-12) (obtenu du centre de stockage génétique d'E. coli, Université de Yale), Escherichia coli ESBL (isolé de l'urine d'un patient de 72 ans atteint de prostatite chronique dans le centre de West-Tallinn Hospital), Pseudomonas aeruginosa PAO1 (obtenu auprès du Pr Patrick Plesiat, Besançon, France), Streptococcus dysgalactiae DSM 23 147 (obtenu auprès de la Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires de l'Institut Leibniz, Braunschweig, Allemagne), E. coli bioluminescent recombinant MC1061 (pSLcueR /pDNPcopAlux, construit dans notre laboratoire précédemment par Ivask et al.34), Enterococcus faecalis ATCC 29 212 (obtenu de l'hôpital central de West-Tallinn) et Staphylococcus aureus ATCC 25 923 (obtenu de l'hôpital central de West-Tallinn) ont été stockés sur Luria gélosé – Milieu Bertani (LB, 1 % tryptone, 0,5 % extrait de levure, 0,5 % NaCl, 1,5 % gélose) et avant les tests cultivés dans 3 mL de RPMI à 37 °C sous agitation à 200 tr/min pendant une nuit. Après une nuit de culture, 400 µl d'inoculum ont été mélangés avec 20 ml de RPMI CCM et incubés pendant 4 h et cultivés jusqu'à la phase exponentielle. Après l'incubation, la densité optique de la suspension bactérienne à 620 nm (DO620) a été mesurée et la suspension à la DO620 souhaitée a été préparée. Dans le cas des bactéries recombinantes, le RPMI CCM a été complété avec 100 µg/l d'ampicilline et 10 µg/l de tétracycline pour conserver le plasmide codant pour la bioluminescence.

Le CMB a été déterminé par la concentration la plus faible qui tue 99,9 % de la population bactérienne initiale en utilisant le test ponctuel décrit par Suppi et al.42. Après une nuit de culture et une incubation de 4 h jusqu'à la phase exponentielle, comme décrit précédemment, la suspension bactérienne avec OD620 0,07 (correspond à 2 × 108 cellules/mL43) dans MQ, RPMI CCM ou LB a été obtenue. 100 μL de suspension bactérienne ont été ajoutés à 100 μL de composants seuls ou leur mélange dans le milieu. Les bactéries ont été exposées dans du RPMI CCM, LB ou MQ sur des microplaques à 96 puits (BD Falcon) à 30 ° C pendant 24 h sans agitation dans l'obscurité. 3 µl de suspension incubée ont été pipetés sur du milieu LB gélosé et la viabilité des cellules bactériennes (formation de colonies) a été évaluée visuellement après 24 h d'incubation. Chaque expérience a été répétée au moins trois fois.

Les bactéries ont été préparées pour le test comme décrit dans le paragraphe "Evaluation de la concentration minimale bactéricide (MBC)". La suspension bactérienne avec OD620 0,03 dans MQ, RPMI CCM ou LB a été incubée pendant 3 h à 37 ° C dans un agitateur et la densité bactérienne à OD620 a été mesurée.

La perméabilisation de la paroi cellulaire d'E. coli et de P. aeruginosa par AgNO3, cAg, CuO, CuO–COOH, CuO–NH2, CuSO4 et Polymixine B (PB, contrôle positif) a été dosée par l'absorption cellulaire de N-Phénylnaphtalène-1- amine (1-NPN) essentiellement comme décrit par Helander et Mattila-Sandholm44. Contrairement à un environnement hydrophile, la fluorescence de 1-NPN est considérablement améliorée dans un environnement hydrophobe (par exemple, bicouche lipidique membranaire), ce qui en fait un colorant approprié pour sonder l'intégrité de la membrane externe (OM) des bactéries gram-négatives. En bref, 50 µL de 40 µM 1-NPN et 50 µL du composé testé dans 50 mM d'acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS) ajusté avec une base de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (TRIS) à pH 7,2 (MOPS-TRIS tampon) ont été pipetés dans les puits de microplaques noires. 100 µL de suspension bactérienne dans du tampon MOPS-TRIS 50 mM avec DO = 0,5 ont été distribués dans chaque puits et la fluorescence a été mesurée après 30 min d'incubation à TA (luminomètre à plaque Fluoroskan Ascent FL ; filtres d'excitation/émission 350/460 nm). Le facteur d'absorption cellulaire 1-NPN a été calculé et présenté sous la forme d'un rapport entre l'intensité des valeurs de fluorescence de la suspension bactérienne incubée avec et sans les composés d'essai. Au moins trois expériences indépendantes ont été réalisées en double technique.

L'induction de la luminescence dans les bactéries par des ions Ag et Cu intracellulaires a été réalisée à l'aide de bactéries biocapteurs recombinantes Escherichia coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux). La réponse des E. coli recombinants aux ions Ag et Cu intracellulaires est médiée par la protéine activatrice CueR et son promoteur copA régulé qui est fusionné aux gènes codant pour la bioluminescence34. Ainsi, dans la région subtoxique, la présence d'ions intracellulaires Ag et Cu conduit à l'augmentation de la bioluminescence de ces bactéries recombinantes de manière dose-dépendante.

La préparation des bactéries testées et la procédure du test du biocapteur étaient analogues au test d'inhibition de la croissance bactérienne à une exception près : le milieu de croissance du biocapteur Ag bioluminescent E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux) a été complété avec 100 µg/l d'ampicilline et 10 µg/l de tétracycline pendant une nuit de culture pour maintenir les plasmides recombinants. Le luminomètre à plaque Orion II (Berthold Detection Systems) a été utilisé pour la mesure de la bioluminescence (BL). 100 µl de suspension bactérienne avec OD620 0,1 ont été exposés aux composants ou à leur mélange dans du RPMI CCM (échantillon) ou du RPMI CCM (fond) à 30 °C pendant 4 h. Les courbes dose-réponse du biocapteur Ag et Cu ont été obtenues en traçant les concentrations appliquées de Cu et Ag par rapport à la bioluminescence du biocapteur Ag/Cu (en tant qu'induction de pli) dans les échantillons respectifs. La concentration avec la valeur de bioluminescence la plus élevée de chaque composant a été marquée comme le pic de LC. L'induction de pliage a été calculée comme suit :

où BLsample est la bioluminescence du biocapteur Ag/Cu dans l'échantillon et BLbackground est la bioluminescence de fond compte tenu de l'assombrissement de la luminescence due aux NP.

Étant donné que la présence de cellules peut influencer la génération et la neutralisation des ROS, les ROS ont été quantifiés dans les conditions biotiques (en présence de cellules) et abiotiques (sans cellules).

Pour étudier la production de ROS cellulaires (biotiques), un stock frais de diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine (H2DCFDA) a été dissous dans de l'éthanol à une concentration de 0, 6 mg / ml, puis dilué dans un tampon phosphate de sodium 0, 1 M. 100 µL de composant dans de l'eau MQ ont été pipetés dans les puits. Ensuite, 100 µL de culture bactérienne (E. coli K-12 à OD620 = 0,1) dans de l'eau MQ ont été ajoutés. Les plaques de test ont été incubées à 30°C pendant 4h. Après incubation, 100 μL du mélange ont été aliquotés dans des plaques noires non transparentes à 96 puits, et du H2DCFDA a été ajouté aux cellules à une concentration finale de 1,5 μg/mL. Après 30 min d'incubation, la fluorescence a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (excitation/émission à 485/527 nm). Dans le test, H2DCFDA diffuse à travers la membrane cellulaire et est transformé par des estérases intracellulaires en une dichlorofluorescine non fluorescente (DCFH). La DCFH est ensuite convertie en 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF) hautement fluorescente en raison de la présence de ROS intracellulaires.

Pour étudier les ROS dans des conditions abiotiques, le groupe acétate de H2DCFDA a été clivé par NaOH 0, 01 M à température ambiante pendant 30 min. Le colorant a été dilué avec un tampon Na-phosphate 0,1 M à une concentration de 24 µg/mL, puis ajouté à chaque puits dans les plaques noires non transparentes à 96 puits, pour donner une concentration finale de colorant de 12 µg/mL. Les résultats ont été divisés par le blanc et présentés sous forme d'unités lumineuses relatives (RFU).

Pour l'analyse de dissolution, 100 mg/l de cAg, Ag2O, nAg, AgNO3, CuSO4 (un contrôle de récupération) ont été incubés dans de l'eau MQ ou dans du RPMI CCM à 37 °C pendant 24 h, puis centrifugés à 320 000 x g pendant 30 min ( ultracentrifugeuse Beckman Coulter). Après centrifugation, les surnageants ont été récupérés et la concentration en argent analysée par AAS (contrAA 800, Analytik Jena Ag). Le pourcentage de dissolution des NP a été calculé en fonction de la concentration en argent dans le surnageant après centrifugation, 100 mg/l étant pris comme 100 %. Les mesures ont été faites en triple dans au moins deux expériences indépendantes.

La détection de Cu+ a été réalisée par la méthode iodométrique45. Le Cu2+ était masqué par une formation de complexe avec l'oxalate de potassium ; puis, le Cu+ a été oxydé en Cu2+ par l'iodate de potassium en présence d'acide chlorhydrique 2 M en utilisant la solution d'amidon à 1 % comme indicateur de la présence d'iode, qui apparaît lorsque la réaction est terminée.

Les valeurs P à l'aide du test t de Student, les écarts types et les valeurs moyennes ont été calculées dans Microsoft Excel.

Les données utilisées et/ou analysées au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A. & Karlén, A. Le pipeline antibactérien préclinique mondial. Nat. Rév. Microbiol. 18, 275-285 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Murray, CJ et al. Fardeau mondial de la résistance bactérienne aux antimicrobiens en 2019 : une analyse systématique. Lancette 399, 629–655 (2022).

Article CAS Google Scholar

Armstrong, DG et Lipsky, BA Singh2005.Pdf Ulcer.Pdf. 293, 217-228 (2005).

Theuretzbacher, U. Antibiotiques à double mécanisme. Nat. Microbiol. 5, 984–985 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

León-Buitimea, A., Garza-Cárdenas, CR, Garza-Cervantes, JA, Lerma-Escalera, JA & Morones-Ramírez, JR conception. Devant. Microbiol. 11, 1–10 (2020).

Article Google Scholar

Kornblatt, AP, Nicoletti, VG & Travaglia, A. Le rôle négligé des ions de cuivre dans la cicatrisation des plaies. J.Inorg. Biochimie. 161, 1–8 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bari, A. et al. Nanoparticules de verre bioactif mésoporeux contenant du cuivre comme agent multifonctionnel pour la régénération osseuse. Acta Biomater. 55, 493–504 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kurvet, I., Kahru, A., Bondarenko, O., Ivask, A. & Ka, A. Le contact particule-cellule améliore l'activité antibactérienne des nanoparticules d'argent. PLoS ONE 8, e64060 (2013).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bondarenko, OM et al. La membrane plasmique est la cible de l'action antibactérienne rapide des nanoparticules d'argent chez Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa. Int. J. Nanomed. 13, 6779–6790 (2018).

Article CAS Google Scholar

Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, HC et Kahru, A. Toxicité de ZnO, CuO et TiO2 nanométriques et en vrac pour les bactéries Vibrio fischeri et les crustacés Daphnia magna et Thamnocephalus platyurus. Chimiosphère 71, 1308–1316.

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Bondarenko, O., Ivask, A., Käkinen, A. & Kahru, A. Effets sous-toxiques des nanoparticules de CuO sur les bactéries : cinétique, rôle des ions Cu et mécanismes d'action possibles. Environ. Pollution. 169, 81–89 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bondarenko, O. et al. Nanotoxicologie et nanomédecine : Le Yin et le Yang des interactions nano-bio pour la nouvelle décennie. Nano aujourd'hui https://doi.org/10.1016/j.nantod.2021.101184 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kubo, A.-L. et coll. La carboxylation de surface ou PEGylation diminue la cytotoxicité des nanoparticules de CuO pour les cellules humaines in vitro sans compromettre leurs propriétés antibactériennes. Cambre. Toxicol. 94, 1561-1573 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kubo, AL et al. Puissance antimicrobienne de nanoparticules d'argent de 10 et 50 nm enrobées différemment contre les bactéries cliniquement pertinentes Escherichia coli et Staphylococcus aureus. Colloïdes Surf. B 170, 401–410 (2018).

Article CAS Google Scholar

Fisher, K., Pope, M. & Phillips, C. Effet combiné du cuivre et de l'argent contre Pseudomonas aeruginosa. J.Hosp. Infecter. 73, 180-182 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vaidya, MY, McBain, AJ, Butler, JA, Banks, CE & Whitehead, KA Efficacité antimicrobienne et synergie des ions métalliques contre Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii dans les phénotypes planctoniques et biofilms. Sci. Rep. 7, 5911 (2017).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yayha, MT, Kutz, SM, Landeen, LK & Gerba, CP Désinfection des piscines : évaluation de l'efficacité du cuivre : ions d'argent. J. Environ. Santé 51, 282-285 (1989).

CAS Google Scholar

Landeen, LK, Yahya, MT & Gerbal, CP Efficacité des ions cuivre et argent et réduction des niveaux de chlore libre dans l'inactivation de Legionella pneumophila. Appl. Environ. Microbiol. 55, 3045-3050 (1989).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garza-Cervantès, JA et al. Effets antimicrobiens synergiques des traitements combinatoires argent/métal de transition. Sci. Rep. 7, 903 (2017).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tao, Y., Zhou, F., Wang, K., Yang, D. & Sacher, E. Formation d'AgCu NP par la catalyse Ag NP d'ions Cu à température ambiante et leur efficacité antibactérienne : une étude cinétique. Molécules 27, 6951 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, F., Zhu, Y., Yang, L., Yang, DQ et Sacher, E. Catalyse Ag NP des ions Cu dans la préparation des NP AgCu et mécanisme de leur efficacité antibactérienne accrue. Colloïdes Surf. Un Physicochem. Ing. Aspic. 632, 127831 (2022).

Article CAS Google Scholar

Bankier, C. et al. Effets antibactériens synergiques des combinaisons de nanoparticules métalliques. Sci. Rep. 9, 16074 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jang, J. et al. Développement de nanocomposites antibiofilm : Nanoparticules bimétalliques Ag/Cu synthétisées à la surface de nanofeuillets d'oxyde de graphène. ACS Appl. Mater. Interfaces 12, 35826–35834 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ivask, A. et al. Toxicité de 11 nanoparticules d'oxyde métallique pour trois types de cellules de mammifères in vitro. Courant. Haut. Méd. Chim. 15, 1914-1929 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Warnes, SL, Caves, V. & Keevil, CW Le mécanisme de la toxicité de la surface du cuivre chez Escherichia coli O157:H7 et Salmonella implique une dépolarisation immédiate de la membrane suivie d'une vitesse de destruction de l'ADN plus lente qui diffère de celle observée pour les bactéries Gram-positives. Environ. Microbiol. 14, 1730-1743 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, X.-Z., Zhang, L. & Poole, K. Interaction entre le système d'efflux multidrogue MexA-MexB-OprM et la barrière membranaire externe dans la résistance multiple aux antibiotiques de Pseudomonas aeruginosa. J. Antimicrobe. Chimimère. 45, 433–436 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Warnes, SL, Green, SM, Michels, HT & Keevil, CW L'efficacité biocide des alliages de cuivre contre les entérocoques pathogènes implique la dégradation des ADN génomiques et plasmidiques. Appl. Environ. Microbiol. 76, 5390–5401 (2010).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eng, RHK, Padberg, FT, Smith, SM, Tan, EN & Cherubin, CE Effets bactéricides des antibiotiques sur les bactéries à croissance lente et à croissance lente. Antimicrobien. Agents Chemother. 35, 1824–1828 (1991).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kohanski, MA, Dwyer, DJ & Collins, JJ Comment les antibiotiques tuent les bactéries : des cibles aux réseaux. Nat. Rév. Microbiol. 8, 423–435 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moubareck, CA Polymyxines et membranes bactériennes : un examen de l'activité antibactérienne et des mécanismes de résistance. Membranes 10, 1–30. https://doi.org/10.3390/membranes10080181 (2020).

Article CAS Google Scholar

Dupont, CL, Grass, G. & Rensing, C. Toxicité du cuivre et origine de la résistance bactérienne - Nouvelles perspectives et applications. Métallomique 3, 1109 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Choi, O. & Hu, Z. Toxicité du nanoargent liée à la taille et aux espèces réactives de l'oxygène pour les bactéries nitrifiantes. Environ. Sci. Technol. 42, 4583–4588 (2008).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Bondarenko, O. et al. Toxicité des nanoparticules d'Ag, de CuO et de ZnO pour des organismes de test et des cellules de mammifères sélectionnés et pertinents pour l'environnement in vitro : un examen critique. Cambre. Toxicol. 87, 1181-1200 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ivsak, A., Rõlova, T. & Kahru, A. Une suite de souches bactériennes luminescentes recombinantes pour la quantification des métaux lourds biodisponibles et les tests de toxicité. BMC Biotechnol. 9, 1–15 (2009).

Google Scholar

Gnanadhas, DP, Ben Thomas, M., Thomas, R., Raichur, AM & Chakravortty, D. L'interaction des nanoparticules d'argent avec les protéines sériques affecte leur activité antimicrobienne in vivo. Antimicrobien. Agents Chemother. 57, 4945–4955 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Popov, S. et al. Facteurs renforçant l'effet antibactérien des ions cuivre monovalents. Courant. Microbiol. 77, 361–368 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Saphier, M., Silberstein, E., Shotland, Y., Popov, S. et Saphier, O. Prévalence du cuivre monovalent par rapport au divalent pour tuer Escherichia coli et Staphylococcus aureus. Courant. Microbiol. 75, 426–430 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rapisarda, VA, Montelongo, LR, Farias, RN & Massa, EM Caractérisation d'une activité de réductase cuivrique liée au NADH de la chaîne respiratoire d'Escherichia coli. Cambre. Biochimie. Biophys. 370, 143-150 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Muppidathi, M. & Perumal, P. Ag@CuO@Cu(OH)2 : Un catalyseur synergique pour la détection de H2O2 avec une activité imitant la peroxydase sans interférence de l'O2. ChimieSelect 6, 10253–10257 (2021).

Article CAS Google Scholar

Käkinen, A., Kahru, A., Nurmsoo, H., Kubo, A.-L. & Bondarenko, OM Toxicité axée sur la solubilité des nanoparticules de CuO sur les cellules CaCo2 et Escherichia coli : effet de l'énergie de sonication et de l'environnement de test. Toxicol. In Vitro 36, 172–179 (2016).

Article PubMed Google Scholar

Blinova, I. et al. Toxicité de deux types de nanoparticules d'argent pour les crustacés aquatiques Daphnia magna et Thamnocephalus platyurus. Environ. Sci. Pollution. Rés. 20, 3456–3463 (2013).

Article CAS Google Scholar

Suppi, S. et al. Une nouvelle méthode de comparaison des propriétés biocides des nanomatériaux aux bactéries, levures et algues. J. Hazard. Mater. 286, 75–84 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Silvestro, L. et al. Activités antibactériennes et antimembranaires de la cécropine A chez Escherichia coli. Antimicrobien. Agents Chemother. 44, 602–607 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Helander, IM Évaluation fluorométrique de la perméabilisation bactérienne Gram-négative. 213-219 (2000).

Jabber, MSA & Stephen, WI La détermination titrimétrique du cuivre (I), du cuivre (II) et du cuivre métallique en mélange. Journal de Fresenius pour la chimie analytique 311, 259-264 (1982).

Article CAS Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions le Dr Villem Aruoja (Institut national de physique chimique et de biophysique, Estonie) pour les corrections en anglais du manuscrit.

EIC Accelerator Grant No. 190199469 (NANOWOUND) de la Commission européenne (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). GOVSG16 Bourse du Conseil estonien de la recherche (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). Arengufond_OB Subvention du Fonds de développement de l'Institut national de physique chimique et de biophysique (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). PRG749 Subvention du Conseil estonien de la recherche (Anne Kahru). Subvention COVSG5 de l'Agence de recherche estonienne (Denys Bondar, Yevgen Karpichev). L'étude a été partiellement soutenue par le projet du Fonds européen de développement régional "Emerging orders in quantum and nanomaterials" (TK134).

Laboratoire de toxicologie environnementale, Institut national de physique chimique et de biophysique, Akadeemia tee 23, 12618, Tallinn, Estonie

Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Heiki Vija, Anne Kahru & Olesja Bondarenko

Nanordica Medical OÜ, Vana-Lõuna tn 39a-7, 10134, Tallinn, Harjumaa, Estonie

Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo & Olesya Bondarenko

Département de chimie et de biotechnologie, Université de technologie de Tallinn, Akadeemia tee 15, 12618, Tallinn, Estonie

Grigory Vasiliev, Denys Bondar & Yevgen Karpichev

Académie estonienne des sciences, Kohtu 6, 10130, Tallinn, Estonie

Mère Kahru

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Conceptualisation, GV, OB ; Curation des données, GV et A.-LK ; Analyse formelle, GV ; Enquête, GV, A.-LK et OB ; Méthodologie, GV, A.-LK, OB, HV et DB ; Administration de projet, OB, AK, YK ; Ressources, AK, YK et OB ; Validation, OB ; Visualisation, GV ; Rédaction de brouillon, GV et OB ; Examen du manuscrit, GV, A.-LK, OB, HV, DB, YK, AK Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance avec Olesja Bondarenko.

A.-LK, GV, OB sont co-fondateurs de Nanordica Medical développant des produits antibactériens à base de nanoparticules. AK, DB, HV et YK ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui autorise l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Vasiliev, G., Kubo, AL., Vija, H. et al. Effet antibactérien synergique des nanoparticules de cuivre et d'argent et leur mécanisme d'action. Sci Rep 13, 9202 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

Télécharger la citation

Reçu : 27 janvier 2023

Accepté : 04 juin 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.